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    【用液相色谱-PITC柱前衍生法对老酸奶中掺水解动物蛋白检测方法的研究】 液相色谱法提高柱效的途径

    分类:研究生 时间:2019-05-31 本文已影响

      摘 要】本文采用PITC柱前衍生法,利用液相色谱和氨基酸分析柱,对老酸奶中L-羟脯氨酸进行分析检测。该方法的回收率在89.95%-92.16%之间,变异系数在4.33%-5.96%之间。本法具有检测结果准确,方法稳定性好,回收率高等优点,可用于老酸奶及乳制品中是否含有皮革成分的鉴别。
      【关键词】柱前衍生;老酸奶;L-羟脯氨酸;液相色谱  0.引言
      最近一则关于“果冻,老酸奶是由破皮鞋做成的”消息在网上流传,因破皮鞋可以提炼出明胶。明胶是一种极为常见的食品添加剂,是从牛、猪等动物骨和皮中的胶原通过变性而制得的变性蛋白质,其化学组成与胶原基本相同,主要成分是胶原蛋白。老酸奶等乳制品为了保持其口感和外观,会适当添加明胶等食品添加剂,这是国家允许使用的。而皮革制成的明胶透明,无味,消费者根本无法区分。本文通过检测皮革水解蛋白来区分食用明胶和皮革制成的明胶。皮革水解蛋白多用皮革厂制作服装、皮鞋后的下脚料来生产,自然这种蛋白中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进去的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质,如果长期食用含有皮革水解蛋白的食物,金属铬离子便会被人体吸收、积累、中毒,使人体关节疏松肿大,严重的会患上癌症。对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定,主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。L-羟脯氨酸是胶原蛋白(皮革水解蛋白)特有的氨基酸,在乳酪蛋白中则没有,所以一旦检出,则可认为含有皮革水解蛋白,即可判断该乳制品中含有由废弃皮革而来的成分。
      本文提供了乳制品中L-羟脯氨酸的检测方法,采用异硫氰酸苯酯PITC柱前衍生法,利用液相色谱和氨基酸分析柱,对L-羟脯氨酸进行分析检测。该方法检测结果准确,方法稳定性好,可用于老酸奶等乳制品中是否含有皮革成分的鉴别。
      1.材料与方法
      1.1原理
      样品经蛋白水解试剂水解,释放出L-羟脯氨酸,然后用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生,采用液相色谱仪测定,外标法定量。
      1.2仪器
      液相色谱仪(附紫外检测器);旋转蒸发仪;分析天平(感量0.1mg);离心机;涡旋混合器;恒温水浴振荡器。
      1.3试剂
      1.3.1乙腈(色谱纯);甲醇(色谱纯);正己烷(分析纯);L-羟脯氨酸标准品≥90%
      1.3.2蛋白水解试剂:称取0.1g苯酚置于100mL容量瓶,加入50mL浓盐酸,加水定容至100mL。
      1.3.3 0.1mol/LHCl水溶液:量取8.3mL浓盐酸,用纯水定容至1000mL。
      1.3.4衍生剂PITC溶液:将250μL异硫氰酸苯酯(PITC)用乙腈定容至10mL。
      1.3.5三乙胺溶液:将1.4mL三乙胺用乙腈定容至10mL。
      1.3.6标准溶液储备液:称取一定量L-羟脯氨酸,用0.1mol/LHCl水溶液溶解,得到浓度为1mg/mL的储备溶液。
      1.3.7标准溶液使用液:将储备液用0.1mol/L HCl水溶液稀释,得到浓度为10μg/mL的L-羟脯氨酸溶液。
      1.4样品水解
      称取奶粉0.1g或老酸奶0.5g(精确到0.1mg),置于20mL蛋白水解瓶中(迪马公司生产),加入10mL蛋白水解试剂,旋紧盖子,振荡混匀,然后置110±1℃烘箱中水解24小时。水解完毕,用超纯水将水解液全部转移至蒸馏瓶中,75℃下减压蒸馏至近干。用0.1mol/L HCl水溶液分三次溶解残渣,定容至25mL容量瓶中,混匀,待衍生。
      1.5样品衍生
      准确量取200μL标准和样品水解溶液,分别置于2mL样品瓶中,各加入100μL三乙胺溶液和100μL衍生剂PITC溶液,混匀,室温放置1h,再分别加入400μL正己烷,旋紧盖子后剧烈振荡5~10s,静置分层,分别取下层溶液,经0.22μm针式过滤器过滤,待分析。
      1.6测定
      1.6.1分析条件
      色谱柱:DiamonsilAAA250×4.6mm,5μm
      流 速:1.0mL/min
      检测器:UV254nm
      柱 温::45℃
      进样量:10μL
      流动相A:0.05mol/L乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH值为6.50±0.05)
      流动相B:甲醇:乙腈:水=20:60:20
      梯度程序
      1.6.2测定
      按仪器操作规程,依次注入标准工作溶液和样品处理液,将标准浓度,称样量和稀释体积输入计算机中,仪器测定结果后自动计算结果并打印。
      2.结果与讨论
      2.1添加回收结果及变异系数
      表一 奶粉中添加回收结果及变异系数
      表二 老酸奶中添加回收结果及变异系数
      L-羟脯氨酸标准5μg/mL液相色谱图
      奶粉中添加L-羟脯氨酸(添加水平5μg/mL)
      的液相色谱图
      老酸奶中添加L-羟脯氨酸
      (添加水平5μg/mL)的液相色谱图
      通过上述表格可以看出:奶粉和老酸奶通过加标测定,回收率均在89.95%-92.16%之间,回收效果很好,变异系数在4.33%-5.96%之间也在规定范围内。
      2.2结论
      根据上述实验可知:采用PITC柱前衍生法,利用液相色谱和氨基酸分析柱,对老酸奶及乳制品中L-羟脯氨酸进行分析检测。该方法具有检测结果准确,方法稳定性好,回收率高等优点,可用于老酸奶及乳制品中是否含有皮革成分的鉴别。
      【参考文献】
      [1]田艳玲,孙妍,陈婧,索娅.乳与乳制品中动物水解蛋白L-羟脯氨酸测定法[J].中国乳品工业,2009,37(6):51-52.
      [2]刘婷,姜金斗,刘宁.HPLC-OPA柱后衍生离子交换法对乳粉中掺水解动物蛋白检测方法的研究[J].食品工业科技,2007,(7): 207-209.

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