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  • 快速法提取DNA 提取板栗DNA的CTAB法和SDS法的比较

    分类:六月思想汇报 时间:2019-05-23 本文已影响

      摘要:分别采用十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法和十二烷基磺酸钠(SDS)法提取板栗(Castanea mollissima BL.)基因组DNA,取适量DNA进行琼脂糖凝胶电泳,并利用紫外可见分光光度计测定所提取的DNA在260和280 nm的吸光度及其比值,利用Eco RⅠ和MseⅠ双酶切后进行随机扩增长度多态性(AFLP)分析。结果表明,两种方法均能从板栗中提取出一定质量的、比较完整的、纯度比较高的DNA,SDS法提取的板栗DNA的纯度更高、质量更好。
      关键词:板栗(Castanea mollissima BL.);DNA提取;十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法;十二烷基磺酸钠(SDS)法;随机扩增长度多态性(AFLP)
      中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2012)14-3101-03
      
      Comparison of CTAB and SDS Methods for DNA Extracion of Chestnut
      WANG Shao-bin1,CHENG Shui-yuan2,3,WANG Yan2,XU Feng1,JIANG De-zhi1,2,CHEN Hui-juan1,
      LI Lin-ling2,3,CHENG Hua2,3
      (1. College of Horticulture and Gardening, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China;
      2. Hubei Key Laboratories of Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources, Huanggang 438000, Hubei, China; 3. College of Chemistry and Life Science, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, Hubei, China)
      Abstract: Genomic DNA of chestnut(Castanea mollissima BL.) was extracted by CTAB method and SDS method. The DNA extracted was tested by agarose gel electrophoresis and spectrophotometry, and then double digested by EcoRⅠ and MseⅠ for AFLP. The results showed that the DNA extracted by both methods was with good quality and high purity while DNA extracted by SDS method was with higher quality and purity compared with CTAB method.
      Key words: Castanea mollossima BL.; DNA extraction; CTAB method; SDS method; AFLP
      板栗(Castanea mollissima BL.)是壳斗科栗属落叶乔木,是一种重要的园艺作物,其经济栽培价值高[1]。迄今为止,人们对板栗的研究很多,但多集中于板栗的种植、病虫害防治及板栗壳的利用等方面,而对板栗基因组DNA的研究相对较少。基因组DNA的提取及DNA分子标记的应用是构建基因文库和遗传图库等分子生物学研究的基础[2-4]。由于板栗富含酚类、糖类、脂肪、色素以及单宁等次生代谢物,给获得板栗基因组DNA带来了较大困难,提取高质量DNA更加不易。此外,传统方法提取的DNA得率低、纯度低,难以进行酶切及PCR扩增,进而影响随机扩增长度多态性(AFLP)等技术在板栗上的应用。采用十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法和十二烷基磺酸钠(SDS)法分离板栗基因组DNA,通过比较这两种方法提取的DNA的质量,以期优化板栗高质量DNA模板提取的方法,旨在为板栗的分子水平研究打下基础。
      1 材料与方法
      1.1 材料
      板栗果实取自于罗田县胜利镇板栗试验基地,品种为“罗田乌壳栗”。将果实用液氮速冻后放入
      -80 ℃低温冰箱里保存过夜,然后撕去外壳及内皮层以外部分,分离果肉,将其剪碎,加液氮研磨。
      1.2 方法
      1.2.1 DNA的提取方法
      1)CTAB法。参照Loh等[5]的方法并加以改良来提取板栗的基因组DNA,具体步骤如下:①取5 g新鲜的板栗果实于液氮中研磨至粉末,迅速转移到10 mL离心管中;②加入4 mL于65 ℃预热的CTAB提取液(20 g/L CTAB、pH 7.5的100 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0的50 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl),于65 ℃水浴1 h;③以10 000 r/min离心12 min后,取上清液加入等体积的体积比为24∶1的氯仿、异戊醇混合液,充分混匀,于冰上静置10 min;④以10 000 r/min离心12 min,取上清液,加入等体积的异丙醇于-20 ℃沉淀20 min;⑤以10 000 r/min离心10 min,取沉淀,用体积分数为75%的乙醇清洗沉淀3次,每次30 min;⑥用适量的TE缓冲液溶解DNA,并加入5 μL RNaseA,于37 ℃水浴30 min消化RNA;⑦加入等体积的体积比为24∶1的氯仿、异戊醇混合液,抽提2次;⑧用2倍体积的体积分数为95%的乙醇和1/10体积的3 mol/L NaAc沉淀DNA;⑨用体积分数为75%的乙醇清洗DNA 3次;自然干燥后,加100 μL TE缓冲液溶解DNA。

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